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安全衛生情報センター
別紙(2)
尿中デルタアミノレブリン酸測定法
浦田グラニツク法(J.Biol chem，Vol 238．PP811．1963)
１ 原理
2種類のイオン交換樹脂を用いて、δ−ALAを分離し、ALAピロールをつくり、これをエールリツヒ試
薬によつて赤色に発色させ、比色定量する。
２ 器具
カラム (3) 内径9mm前後 長さ30cm
但し、3本のうち1本の長さ10cmのものでよい。
比色計 (1) 552mμ
フイルター式の場合はその近くのフイルターを用いる。
その他、試験管、pHメーター又はpH試験紙、三角フラスコ、コガラス棒、ピペツト類、煮沸用湯浴器、
ロート、脱脂綿、純水( )内は1検体当りの本数
３ 試薬(後記「参考」参照)
○ 陽イオン交換樹脂 100〜200メツシユ
○ 陰イオン交換樹脂(強塩基性) 200〜400メツシユ
○ メタノール(特)
○ 氷酢酸
○ 酢酸ソーダ(特)
○ アセチルアセトン
○ 塩酸
○ 水酸化ナトリウム
○ 塩化第2水銀(特)
○ 過塩素酸(特)
○ パラジメチルアミノベンズアルデヒト(特)
４ 試薬の調製
(1) 樹脂の調製 陽イオン交換樹脂について
1検体7ml程度必要
三角フラスコに必要量をとり、純水を10〜20倍量加えて振る、放置、上清をすてる。
以上を上清が清澄になるまで(3〜4回)くり返す。上清を捨て、1N・NaOHを樹脂の10倍量加えて混
合、1晩放置。
上清を捨て、樹脂の10〜20倍量の純水で10回ほど洗滌をくり返すと、pHがアルカリ性でなくなる。
1N・HClで2回洗う。
HClがなくなるまで、水で洗う。約10回
酢酸緩衡液(pH4.8)を入れておく。
(2) 樹脂の調製 陰イオン交換樹脂(強塩基性)について
1検体5ml程度必要
(1)のように、水で洗い、ゴミなど除く。
3N、酢酸ソーダを樹脂の10倍量加え、これで3回洗う。もう1度これを加え、1晩放置アルカリ性で
なくなるまで水で洗う。
酢酸ソーダは特級のものでも、クロールイオンclを多量に含むものがあるので事前に硝酸銀でチエ
ツクするとよい。
以上の調製法は、パツチ法である。原法はカラムを用いているが、これだと時間がかかる。
(3) 酢酸バツフアー(pH4.6)1M
氷酢酸57ml水を加えて1lにする。
酢酸ソーダ136g水を加えて1lにする。
pH4.8の酢酸バツフアーは、それぞれ、45mlと100gを加え水で1lにする。
(4) エールリツヒ試薬
以下のものを、その都度つくる、5ml／検体必要
パラジメチールアミノベンズアルデヒト 4g
氷酢酸 168ml
過塩素酸 40ml
塩化第2水銀 0.7g
以上の混合物に、水を加えて全量220mlとする。
(5) メタノール酢酸混合物
容量で2：1に混合
(6) 1M酢酸
５ カラムと尿の調製
(1) カラムの調製
第1カラム 調製した陰イオン交換樹脂
第2カラム 調製した陽イオン交換樹脂
第3カラム 調製した陰イオン交換樹脂
1検体につき3本のカラムをスタンドに垂直にたて、綿栓をつめ、水を流す。
駒込ピペツトで、上記樹脂を均一につめていく。
第1．2．3カラム、それぞれ3．7．1cmの高さまでつめる。
つめたら、その上に綿栓をおく。(図)
(2) 尿の調製
普通の人の尿で3.0ml、鉛作業者ではALAの排泄量によるが、その1／2〜1／3量を試験管にとり、
pHを5％酢酸で5〜6に調節する。
６ 操作
(1) 検体を完全に第1カラムに流し込む。流出液を下で試験管に受ける。
(2) 流下終了後、純水6mlを同一カラムに流し、(1)の試験管に受ける。
(3) (1)と(2)とを併せたもの(流出液)を第2カラムに流し込む。流出液を下で試験管(20〜30ml)に受
ける。
(4) 流下終了後、純水10mlをこのカラムに流し洗う。
洗液は一緒にする。
(5) (4)の流出液に、酢酸バツフア1mlとアセチルアセトン0.5mlを加え、よく混合
(6) 沸澄水溶中に10分間浸し、煮沸する。
(7) 放冷後、第3カラムに流す。流出液はすててよい。
ALAピロールはここに沸縮補捉される。
(8) 1M酢酸5mlをこのカラムに流して洗う。流出液はすてる。
(9) 10ml目盛付試験管をカラムの下に置き、カラムにメタノール酢酸4mlを流し、ALAピロールを流出
せしめる。
(10) 5mlの目盛までメタノール酢酸を加える。
(11) エールリツヒ試薬5.0mlを加え、混合。
(12) 混合後15分で比色 552mμ
７ 標準線の作成
原法は、Molar absorbancy 5.3×104として、計算している。
ALAは容易に手に入るので、これを購入して、自ら検量線を作つてもよい。その場合は次のようにす
る。
(1) ALA標品
ALA・HCl 分子量 167.6
ALA 分子量 131.1
(ALA塩酸塩結晶100mgがアンプル入りで売り出されている。)
(2) 適用量のALA・HClを化学天秤で正確に秤りとり、水を加え、pHを5〜6に調節、更に水を加えて、
ALAとして、10mg／lの標準液をつくる。
(3) これを稀釈して、1．2．3．5mg／lの濃度階段の標準液稀釈系列をつくつて、尿と同様の操作で分
離、比色する。
注：尿ALAの測定には、各種の簡便法が工夫されている。これらの簡便法を用いる場合には本法に
対して比較、較正するこよが必要である。なお、一般には、別添の測定法(Mauzcrall−Granick法)
も普及しているので、これによる場合も差し支えないこと。
参考：試薬中の陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂については、浦田グラニシク法の場合、次
のものが用いられている。
陽イオン交換樹脂……アンバーライトIRC50
陰イオン交換樹脂……ダウエツクス1×8
(別紙(2) 別添)
尿中デルタアミノレブリン酸測定法
原理
δ−ALAはアセチルアセトンとの縮合によりピロールを作る。ピロールはエールリツヒ試薬のPジメチル
アミノベンツアルデヒドと酸性溶液で赤色化合物を形成する。エールリツヒ試薬による反応に影響を及ぼ
す尿中の還元物質はあらかじめカラムにより分離を行う。
試薬および器具(後記「参考」参照)
１ 陰イオン交換樹脂 200−400メツシユ
陽イオン交換樹脂 200−400メツシユ
２ 4N、2N、1N−塩酸溶液
３ 3M、0.5M−酢酸ソーダ溶液
４ 1M−酢酸溶液
５ アセチルアセトン
６ 酢酸緩衡液(pH4.6)
酢酸ソーダNaCH3CO23H2Oの136gに氷酢酸57mlを加え、蒸留水で1lとする。
７ エールリツヒ試薬
P−ジメチルアミノベンツアルデヒド1gを約30mlの氷酢酸にとかし、過塩素酸HClO4(70％)、8.0ml
を加える。その後氷酢酸で50mlとする。この試薬は使用の都度作成する。
８ カラム(内径10mmと8mmの2種類)
９ ウオーターバス
10 分光光電光度計
定量操作法
１ 前処理
陰イオン交換樹脂は水洗後3Mの酢酸ソーダ溶液でクロライドフリーになる迄洗い、次に酢酸ソーダが
フリーになるまて蒸留水で洗滌する。
陽イオン交換樹脂は水洗後2N−可性ソーダで一夜放置し、蒸留水で中性になる迄洗滌する。
２ 定量操作
第1カラム(内径10mm)、第2カラム(内径8mm)のそれぞれの底部に樹脂の流出を防ぐためグラスウール
を2〜3mmつめる。
第1カラムには蒸留水に浮かした陰イオン交換樹脂を駒込ピペツトで3ml入れる。
第2カラムには陽イオン交換樹脂を同様に入れ、1.5cmくらいの高さとする。それぞれ蒸留水を通す。
流速は3ml／10minとする。第2カラムには4N−塩酸1ml 1回、2N−塩酸5ml 1回、1N−塩酸5ml 1回
を通す。蒸留水で中性になるまで洗滌する。
1) 第1カラムに尿1mlをホールピペツトで加え、次に蒸留水を2mlずつ5回加える。
2) 滴下液約11mlを第2カラムに加える。蒸留水で洗滌する。この滴下液はすてる。
3) 0.5M酢酸ソーダ溶液2mlずつ4回加え、この滴下液は試験管にとる。
4) アセチルアセトン0.2mlを加え、pH4.6の酢酸緩衡液で10mlとする。
5) 100°Cの水溶中で10分間加熱。
6) 放冷後この溶液2mlをとり、エールリツヒ試薬2mlを加え、15分後に553mμで比色する。
３ カラムの再生
第1カラムに1M−酢酸2ml、0.2M−酢酸2mlで2回洗い、蒸留水で中性になるまで洗滌する。
第2カラムは蒸留水で中性になるまで洗滌する。
計算
吸光度×47＝mg／l
参考：試薬中の陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂については、Mauzerall−Granick法の場合次の
ものが用いられている。
陰イオン交換樹脂……ダウエツクス2×8
陽イオン交換樹脂……ダウエツクス50×8
